EnglishVật liệu cần thiết và phương pháp:
Chế độ ăn thử nghiệm
Theo nhu cầu dinh dưỡng tôm bố mẹ của tôm thẻ chân trắng, 4 khẩu phần có 52,4% protein thô và 14,2% lipid thô được tính có chứa 4% lecithin đậu nành (PC + PE >70%), lecithin lòng đỏ trứng (PC + PE >80%), hoặc dầu Krill (PC + PE >40%). Một chế độ ăn không bổ sung phospholipid được đặt làm đối chứng trong thí nghiệm. Hàm lượng protein thô và lipid thô trong khẩu phần được phát hiện tương ứng bằng phương pháp đốt Dumas và chiết Soxhlet (Bảng 1).
- Bột cá, gelatin và casein được sử dụng làm nguồn protein.
- Cholesterol, dầu cọ, dầu cá và phospholipid đóng vai trò là nguồn lipid trong công thức.
- Các nguyên liệu thô dạng hạt được nghiền bằng máy xay và sau đó được nghiền thành bột qua rây 80. Tất cả các nguyên liệu thô được thêm vào và trộn đều trước khi thêm các thành phần lỏng (dầu và hai lượt nước cất) vào nguyên liệu khô.
- Khối bột này được chuyển sang máy nghiền xoắn kép (model: CD4-1TS) để đùn thành các hạt có đường kính 2,5 mm và sấy khô ở nhiệt độ phòng. Tất cả các khẩu phần ăn được bảo quản trong túi nhựa kín ở -20°C cho đến khi sử dụng. Thành phần axit béo của 4 chế độ ăn được thể hiện trong Bảng bổ sung .
BẢNG DINH DƯỠNG CÁM CÔNG THỨC CHO TÔM BỐ MẸ
Theo nhu cầu dinh dưỡng tôm bố mẹ của tôm thẻ L. vannamei ( 20 , 25 ), bốn khẩu phần ăn với 52,4% protein thô và 14,2% lipid thô được xây dựng có chứa 4% lecithin đậu nành (PC + PE >70%), lecithin lòng đỏ trứng (PC + PE >80%), hoặc dầu nhuyễn thể (PC + PE >40%). Một chế độ ăn uống không bổ sung phospholipid đã được đặt làm đối chứng trong thí nghiệm.
Công thức dinh dưỡng (g/kg thức ăn khô) và tỷ lệ thành phần (%) của 4 chế độ ăn thử nghiệm dành cho tôm mẹ thẻ chân trắng.
| Thành phần trộn | Chế độ ăn thử nghiệm | |||
| Chế độ ăn không bổ sung Phospholipid | Lecithin đậu nành | Lecithin lòng đỏ trứng | Dầu krill | |
| Bột cá | 200 | 200 | 200 | 200 |
| Casein | 320 | 320 | 320 | 320 |
| Gelatin | 80 | 80 | 80 | 80 |
| Tinh bột ngô | 150 | 150 | 150 | 150 |
| Dầu cá | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Lecithin đậu nành | 0 | 40 | 0 | 0 |
| Lecithin lòng đỏ trứng | 0 | 0 | 40 | 0 |
| Dầu krill | 0 | 0 | 0 | 40 |
| Cholesterol | 5 | 5 | 5 | 5 |
| Dầu cọ | 80 | 40 | 40 | 40 |
| Butylated hydroxytoluene | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Anhydrous calcium carbonate | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Calcium lactate pentahydrate | 4 | 4 | 4 | 4 |
| Choline chloride | 5 | 5 | 5 | 5 |
| Inositol | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
| Betaine | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Vitamin premixa | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Mineral premixb | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Carboxymethyl cellulose | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Cellulose | 70,75 | 70,75 | 70,75 | 70,75 |
| Tổng cộng | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| Thành phần được phân tích (%) | ||||
| Độ ẩm | 7,51 | 7,43 | 7,78 | 7,42 |
| Protein thô | 52,33 | 52,15 | 52,50 | 52,47 |
| Lipid thô | 14,28 | 14,40 | 14,05 | 14,22 |
| Tro | 8,31 | 8,30 | 8,28 | 8,31 |
Hỗn hợp vitamin (trên 1.000 g hỗn hợp sẵn): vitamin A axetat (500.000 IU/g), 0,480; L-ascorbyl-2-polyphosphate 35% C hoạt tính, 35,710; axit folic, 0,180; 2% biotin, 2,5; riboflavin, 3; DL- Ca-pantothenate, 5; 99% pyridoxine HCl, 1; 1% vitamin B12 là 0,200; thiamin HCl, 0,500; menadione, 2; DL-alpha-tocopheryl axetat (250 IU/g), 8; axit nicotinic, 5; vitamin D3 (500.000 IU/g), 0,800; cám gạo đã khử chất béo, 935.630. Tất cả các thành phần chứa đầy α-cellulose đến 1.000 g.
b Hỗn hợp khoáng chất (trên 1.000 g hỗn hợp trộn sẵn): kẽm sulfat monohydrat, 20,585; canxi iodat là 0,117; cupric sunfat pentahydrat, 0,625; mangan sunfat monohydrat là 1,625; magie sunfat monohydrat, 39,860; coban clorua, 0,010; sắt sunfat monohydrat, 11.179; natri selenit, 0,025; canxi hydro photphat dihydrat, 166,442; bột cám lúa mì, 759.532. Tất cả các thành phần chứa đầy α-cellulose đến 1.000 g.
Quản lý việc cho ăn:
Tôm bố mẹ L. vannamei cái được lấy từ một công ty tư nhân địa phương ở Hải Nam, Trung Quốc. Trước khi thử nghiệm cho ăn, tôm được nuôi trong thùng polypropylen hình tròn màu đen (đường kính × chiều cao = 5,8 × 1,1 m) và cho ăn chế độ ăn đối chứng trong 7 ngày để thích nghi với điều kiện thí nghiệm. Sau khi thích nghi, 160 con tôm cái (trọng lượng ban đầu dao động 34,7 ± 4,2 g, chỉ số gan dao động 6,23 ± 0,25%, chỉ số sinh dục dao động 0,51 ± 0,12%) được phân ngẫu nhiên vào 16 thùng (đường kính × chiều cao = 1 m × 0,9 m), với 10 con tôm mỗi thùng và bốn lần lặp lại cho mỗi nhóm khẩu phần. Theo điều kiện cho ăn của thí nghiệm trước và tài liệu tham khảo (26), tôm được cho ăn 7 lần mỗi ngày (7:30, 10:00, 13:00, 15:00, 18:00, 21:00 và 23: 30) ở mức 5,5% sinh khối trong 28 ngày. Thức ăn thừa và phân được loại bỏ bằng ống siphon hai lần mỗi ngày và thay nước (50%) cho đến khi kết thúc thử nghiệm. Các thông số chất lượng nước được kiểm soát ở 28–29°C, pH 7,8–8,4, độ mặn 30–32, oxy hòa tan 5–6 mg/L, nitơ amoniac 0,10–0,30 mg/L, nitrit 0,03–0,10 mg/L và chu kỳ quang 12 giờ trưa và 12 giờ tối trong suốt quá trình thử nghiệm cho ăn.
Lấy mẫu và tính toán:
Buồng trứng và gan tụy của 15 con tôm được thu thập trước thí nghiệm và đo chỉ số tuyến sinh dục và chỉ số gan để thu được giá trị ban đầu. Mỗi ngày soi đèn để quan sát kích thước và màu sắc của tuyến sinh dục trên lưng tôm nhằm đánh giá sự phát triển của tuyến sinh dục. Tỷ lệ phát triển buồng trứng ở giai đoạn III-V được tính vào ngày thứ 7, 14, 21 và 28. Sau thí nghiệm kéo dài 28 ngày, tôm được nhịn ăn trong 24 giờ và được gây mê trong bồn nước đá trong 10 phút trước khi lấy mẫu. Tôm trong mỗi thùng được cân và đếm. Việc lấy mẫu và phân tích được thực hiện từ khi buồng trứng phát triển đến khi trưởng thành (IV–V). Máu của tôm được lấy mẫu từ thể tim bằng ống tiêm vô trùng dùng một lần 1 ml và được bảo quản ở 4°C qua đêm. Gan tụy, cuống mắt và buồng trứng ngay lập tức được tách ra và đông lạnh trong nitơ lỏng, sau đó được bảo quản ở -80°C để phân tích sau. Trước đó, thùy giữa của buồng trứng được cố định trong paraformaldehyde 4% để quan sát mô học bằng phương pháp nhuộm hematoxylin-eosin (H&E) trên các phần mô paraffin. Chỉ số sinh dục (GSI) và chỉ số gan (I) được tính như sau:
Chỉ số sinh dục (GSI, %) = 100 × (trọng lượng buồng trứng ướt/trọng lượng cơ thể ướt).
Chỉ số gan tụy (HSI, %) = 100 × (trọng lượng gan tụy ướt/trọng lượng cơ thể ướt).
Phân tích hormone và chuyển hóa lipid:
Tám mẫu máu cho mỗi lần xử lý, từ 2 con tôm trong mỗi thùng, được ly tâm ở tốc độ 1.500 g ở 4°C trong 10 phút. Chất nổi trên bề mặt được sử dụng để phát hiện hàm lượng 17-β-estradiol (E2), methyl farnesoate (MF), cholesterol toàn phần (T-CHO), lipoprotein mật độ thấp (LDL-C) và lipoprotein mật độ rất thấp (VLDL) ). Việc xác định T-CHO và LDL-C được thực hiện bằng cách sử dụng bộ thuốc thử chẩn đoán. Các phép đo E2, MF và VLDL được thực hiện bằng bộ xét nghiệm miễn dịch enzyme. Các bước thao tác cụ thể được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Tám cuống mắt và gan tụy trong mỗi lần xử lý, từ hai con tôm mỗi thùng, được đồng nhất hóa trong dung dịch muối (0,86%) đã được làm lạnh trước (1:10, w/v) ở tần số 60 Hz ở 4°C trong 30 giây và ly tâm ở tốc độ 1.500 g trong 15 phút ở 4°C (3–18 KS, Sigma, Đức). Sau khi ly tâm, phần nổi phía trên của chất đồng nhất ở cuống mắt được thu thập để đo hàm lượng hormone ức chế tuyến sinh dục (GIH) và hormone ức chế lột xác (MIH) bằng bộ dụng cụ thuốc thử chẩn đoán. Ngoài ra, chất nổi trên bề mặt đồng nhất gan tụy đã được thu thập để đo hàm lượng chất béo trung tính (TG) bằng bộ dụng cụ thuốc thử chẩn đoán. Các bước thao tác cụ thể được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Mô học của buồng trứng:
Các mẫu mô buồng trứng được cố định trong dung dịch paraformaldehyde 4%, sau đó được khử nước, làm sạch và cân bằng bằng ethanol, toluene và xylene. Sau đó, các mẫu được nhúng trong parafin và được cắt bằng máy thái quay có độ dày 5 μm. Các phần buồng trứng được nhuộm bằng hematoxylin-eosin (H & E) và quan sát dưới kính hiển vi. Phần mềm Image-Pro Plus 6.0 được sử dụng để hiệu chuẩn và đo tế bào buồng trứng.
Lipidom buồng trứng:
Bốn mẫu buồng trứng được sao chép từ mỗi nhóm thử nghiệm đã được sử dụng để phát hiện lipidomics dựa trên LC–MS không nhắm mục tiêu. Một mẫu 200 μl được chiết bằng dung dịch chiết 960 μl (MTBE: metanol = 5: 1) có chứa chất chuẩn bên trong. Chất nổi phía trên được điều chế bằng cách xử lý siêu âm và ly tâm.
Mẫu kiểm soát chất lượng (QC) được chuẩn bị bằng cách trộn một lượng bằng nhau (10 μl) chất nổi phía trên từ tất cả các mẫu, sau đó 75 μl chất nổi phía trên được chuyển vào vi lọ LC–MS để phân tích thêm.
Các phân tích LC–MS/MS được thực hiện bằng hệ thống Sắc ký song song chất lỏng hiệu năng cực cao (UHPLC) với Hiện tượng Kinetex Cột C18 (2,1*100 mm, 1,7 μm) kết hợp với phép đo khối phổ TripleTOF 6.600 (AB Sciex).
Giai đoạn A bao gồm 40% nước, 60% axetonitril và 10 mmol/L amoni formate.Giai đoạn B bao gồm 10% axetonitril và 90% isopropanol, được thêm vào 50 ml amoni formate 10 mmol/L cho mỗi 1.000 ml dung môi hỗn hợp.
Việc phân tích được thực hiện với phương pháp rửa giải gradient như sau: 0–12 phút, 40–100% B; 12–13,5 phút, 100% B; 13,5–13,7 phút, 100–40% B; và 13,7~18 phút, 40% B. Nhiệt độ cột là 45°C. Nhiệt độ của bộ lấy mẫu tự động là 4°C và thể tích tiêm là 0,5 μl (dương tính) hoặc 6 μl (âm tính).
Các tệp dữ liệu thô được chuyển đổi thành các tệp ở định dạng mzXML bằng chương trình “msconvert” từ ProteoWizard. Phát hiện đỉnh lần đầu tiên được áp dụng cho dữ liệu MS1. Thuật toán CentWave trong Hệ thống quản lý màu X (XCMS) đã được sử dụng để phát hiện cực đại với phổ MS/MS. Việc xác định lipid đã đạt được thông qua kết hợp quang phổ bằng thư viện LipidBlast. Phân tích thành phần chính (PCA) và phân tích phân biệt bình phương nhỏ nhất một phần (PLS-DA) được sử dụng để tìm và loại trừ các giá trị ngoại lệ trong các mẫu của mỗi nhóm nhằm đảm bảo độ lặp lại tốt và độ tin cậy của dữ liệu trong phạm vi xử lý. Sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm được xác định thông qua PLS-DA trực giao (OPLS-DA) với tầm quan trọng của biến mô hình trong phép chiếu (VIP)> 1, thay đổi lần (FC)> 1 và p <0, 05. Giá trị định lượng của các chất chuyển hóa lipid khác biệt được tính toán bằng ma trận khoảng cách Euclide và được phân cụm bằng cách sử dụng phương pháp liên kết hoàn chỉnh được hiển thị trên bản đồ nhiệt. Các bản đồ nhiệt phân cụm được tạo bằng phần mềm trực tuyến (//software.broadinst acad.org/morpheus/).
Nguồn: National Library of Medicine
